Действие мистерии начинается в местности, расположенной близ рая, где звучит молитва Иегове, в которой участвует всё оставшееся человечество: изгнанные из рая Адам и Ева, их сыновья Каин и Авель, дочери Ада и Селла, а также дети, зачатые дочерьми Ада от сыновей. В отличие от смиренного принятия божественного наказания родителями и Авелем, Каин выражает внутренний протест, являясь символом неутолимого стремления к познанию и сомнения. Он открыто признаётся, что не может согласовать увиденное с услышанным, отвергая уклончивые ответы, основанные на безусловном признании божественной воли и благости.
После того как семья уходит к дневным заботам, Каин остаётся один и ощущает приближение высшего существа, превосходящего ангелов, ранее наблюдаемых им у рая. Это Люцифер. В образе падшего ангела, изгнанного с небес и обречённого на вечное скитание, но не сломленного духом, проявляется новаторское видение автора. В отличие от традиционных представлений, здесь Сатана лишён стереотипной негативности: он не столько даёт прямые ответы, сколько внушает необходимость постоянного поиска истины, подчеркивая, что познание есть путь к бессмертию духа. Люцифер отрицает роль искусителя, заявляя, что соблазняет лишь правдой, что вызывает у Каина доверие.
Исходя из мучительных вопросов о смысле жизни, смерти и непостижимом, Каин просит пришельца прояснить свои сомнения. Люцифер предлагает ему путешествие во времени и пространстве, обещая вернуться в течение нескольких часов. Во втором акте действие переносится в бездну космоса, где, подобно Данте и Вергилию, герои проходят мимо прошлых и грядущих миров, в сравнении с которыми Земля и Эдем кажутся ничтожными. Каину открывается бесконечность времени и пространства, что Люцифер сопровождает комментариями о неизменности этих категорий, несмотря на смертность всего сущего.
На множестве планет, пролетающих перед ними, Каин узнаёт о других эдемах и существах, превосходящих людей. Затем Люцифер показывает ему царство мёртвых, где обитают тени древних, более разумных существ, населявших Землю до Адама. Иегова уничтожил их, изменив лицо земли. Перед глазами Каина проходят образы левиафанов и безымянных теней, величественные и печальные, но, по словам Люцифера, это ничто в сравнении с будущими бедствиями человечества. Каин, любящий Аду и Авеля, не может принять неизбежность гибели всего живого и вновь требует объяснений о смерти. Люцифер отвечает, что смерть следует воспринимать как врата, преддверие к чему-то разумному, что уменьшает страх Каина перед ней.
Каин осознаёт, что его проводник по бескрайним мирам не уступает по могуществу Иегове, но при этом не является его подчинённым. В ответ на сомнение Сатана утверждает, что между ним и Богом ведётся непрекращающаяся борьба, которая закончится лишь гибелью одного из них. На прощание он советует Каину использовать разум, данный древом знания, не подчиняться слепой вере и страху, а терпеть и мыслить, создавая внутренний мир, способный преодолеть земную природу и приблизиться к духовному началу. Бессмертие духа — единственный способ противостоять смертной судьбе, предназначенной человеку.
Возвратившись, Каин обнаруживает близких, занятых подготовкой жертвоприношений. Он отвергает этот акт покорности судьбе, считая, что лучше умереть, чем жить в страданиях и передавать их потомкам. Его протест вызывает страх у Ады, любящей его и их ребёнка, которая мягко, но настойчиво убеждает его принять участие в жертвоприношении вместе с Авелем. В этот момент, хотя Бог не появляется на сцене, его присутствие ощущается: он принимает жертву Авеля и благословляет плоды, принесённые Каином. Авель призывает брата принести новые дары, но Каин отказывается и в приступе гнева убивает Авеля, ударив его головнёй с жертвенника.
Смерть Авеля вызывает скорбь у близких. Адам растерян, Ева проклинает Каина, а Ада пытается защитить его. Адам приказывает Каину покинуть эти места навсегда. С ним остаётся только Ада, но перед началом долгого изгнания на восток от рая Каину предстоит ещё одно испытание — ангел Господень ставит на его лбу неизгладимую печать. Каин принимает наказание, осознавая вину, но дух протеста и сомнения не угасает в нём. Его последние слова обращены к памяти Авеля и выражают одновременно скорбь и вызов, завершая пьесу, которая превращает традиционную мистерию о грехе в глубокое размышление о борьбе человека с божественной властью.
